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本试剂盒提供了一种简便、快速地提取染色质DNA的方法，并增加对小片段DNA的回收，从而增强了检测的敏感性。


细胞核染色质DNA断裂是细胞凋亡的标志特征。在细胞发生凋亡时，核酸内切酶被激活，选择性降解染色质DNA，形成50～300kb的大片段，并进而在核小体连接处断裂，形成180～200bp或其整倍数的DNA片段，这些DNA片段可从细胞中提取出来，通过琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色呈现为梯状条带(DNALadder)，并据此判断细胞凋亡产生。

组分	20T	50T	100T	保存条件
Lysis Buffer	1mL	2.5mL	5mL	4℃
Enzyme A	100μL	250μL	500μL	-20℃
Enzyme B	100μL	250μL	500μL	-20℃
乙酸氨溶液	800μL	2mL	4mL	4℃
Loading Buffer	100μL	300μL	500μL	4℃

保存：-20℃，有效期1年。


高速离心机、微量移液器、涡旋振荡器、凝胶电泳仪、37～55℃水浴锅
冰乙醇、1.5m L Microtube、PBS、胰酶消化液、TE Buffer，琼脂糖，TBE、溴化乙啶、DNA Ladder Marker

1. DNA Ladder出现在细胞凋亡晚期，观察细胞形态已发生皱缩出芽，染色质完全凝聚，细胞核已固缩断裂的凋亡晚期形态，建议该种形态的凋亡细胞比例在30%以上时进行DNA Ladder检测或先进行Tunel检测.
   
2. DNA Ladder出现在一个较短的时间段，在凋亡早期取样，则无DNA降解的条带，而在凋亡末期取样则产生与细胞坏死相似的DNA弥散条芾。因此取样时间需根椐不同种类的细胞和诱导剂而摸索确定。
   
3. 贴壁细胞最好不用胰酶消化而用细胞刮收集。
   
4. 某些细胞不产生这种核小体间的DNA断裂，而是产生50～300kb的大片段断裂。

1. 收集5×10⁵细胞(2000r/min，4℃，离心5min)于1.5mL微量离心管中；
   注意：不要使用过多的细胞，否则，随后的酶解可能不完全，会形成很粘稠的DNA溶液。
   
2. 用PBS洗涤细胞二次(2000r/min，4度，离心5min)，弃上清；
   
3. 沉淀的细胞中每管加入50μL Lysis Buffer，用移液管尖混匀细胞沉淀。
   注意：不要形成强烈的涡旋，否则，高分子量DNA可能会被剪切。以剪过的枪头插入液面下，打入空气轻轻吹动液体混匀。
   
4. 再每管加入5μL Enzyme A溶液，轻弹管尖混匀，不要形成涡旋，37度孵育10～20min；
   
5. 在上述溶液中每管加入5μL Enzyme B溶液，轻弹管尖混匀后，50度孵育30min或至溶液澄清为止；
   
6. 加入40μL醋酸氨和200μL冷无水乙醇，混匀，置于-20℃，静置20～30min；
   
7. 4℃，12000～14000rpm离心10min，小心地弃去上清，收集沉淀的DNA；
   注：出现的DNA沉淀后，若无法用TE buffer溶剂溶解沉淀，可以进行以下操作：重复第4至5步(甚至可以考虑Enzyme B过夜消化)，彻底消化蛋白，可以有效使DNA溶解。
   
8. 加入0.5mL 70%的冷乙醇，洗DNA沉淀，再12000～14000rpm离心10min；
   
9. 弃上清，DNA沉淀于室温干燥10min后，加入10～15μL TE Buffer，充分搅拌溶解DNA；
   
10. 取上述10～15μL样品加入2～3μL Loading Buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳(凝胶和电泳缓冲液TBE均加入0.5μg/mL的溴化乙啶)；
    
11. 5 V/cm电泳1小时，紫外灯下观察并拍照。
    注：电泳条件中5V/cm或2～4V/cm是电场强度的单位，具体实验时量一下正极与负极之间的距离，例如20cm，那么电泳需要的电压为距离×5V/cm=100V。
    
12. 制备1.5%琼脂糖凝胶(也可以用1%)，在上述孵育步骤结束后，每管加入5μL loading buffer混匀，干胶上样。
13. 低电压电泳至2/3处，(2～4V/cm，约4小时)；
    
14. 0.5μg/mL EB染液染色20分钟，紫外灯观察拍照。

相关搜索：细胞凋亡检测试剂盒，DNA Ladder检测试剂盒，Cell Apotosis DNA Ladder Detection Kit